Глава 6 Методы общей диагностики заболеваний иммунной системы
Глава 6 Методы общей диагностики заболеваний иммунной системы
Необходимость иммунологического обследования возникает в случае подозрения на первичную или вторичную иммунологическую недостаточность.
Обследование назначается при наличии у больного хронических бактериальных и вирусных инфекций различных органов; при отсутствии эффекта от проводимого лечения; в случае выявления иммунологических заболеваний при обследовании иммунологического статуса; при трансплантации органов и тканей. В табл. 3 указаны клинические показания для проведения лабораторных иммунологических исследований.
Таблица 3. Клинические показания к постановке лабораторных иммунологических тестов
Правила подготовки пациентов к обследованию, взятие и условия хранения материала для проведения исследования Для исследования используется венозная, капиллярная кровь, слюна, желчь и другие биологические жидкости. Забор крови производится утром натощак путем пункции локтевой вены в сухую чистую пробирку. У новорожденных применяют взятие крови из пуповины. У детей раннего возраста кровь берут из височной, лобной или яремной вены. Для исследования плазмы и форменных элементов крови используются мерные пробирки, в которые вносится антикоагулянт.
Срок хранения крови от момента забора до проведения анализа составляет 2 часа (при комнатной температуре), сыворотки – 48 часов (в холодильнике). Плазму можно хранить более длительно при температуре –20 °C.
Для исследования плазмы используется также капиллярная кровь, которую берут из указательного или безымянного пальца в объеме 0,5 мл в центрифужную пробирку. Плазму получают путем центрифугирования капиллярной крови. Осадок используется для приготовления клеточной суспензии.
Перечень общих требований для исследования и транспортировки материала:
– забор крови производится утром натощак;
– материал для исследования необходимо брать в достаточном объеме;
– материал немедленно должен быть доставлен в лабораторию в специальных контейнерах. Если это невозможно, материал хранят в холодильнике в течение 48 часов;
– материал должен быть промаркирован и иметь сопроводительные документы.
В настоящее время существуют различны методы, обеспечивающие количественную и функциональную оценку иммунной системы.
Некоторые методы исследования иммунного статуса
Количественная оценка содержания иммуноглобулинов (JgA, JgM, JgG) применяется для диагностики иммунной недостаточности и контроля за иммуномодулирующей терапией.
В случае первичных иммунодефицитов определяется снижение концентрации всех иммуноглобулинов или уровень JgA и JgG при нормальных показателях JgM (врожденная гипоглобулинемия) либо снижение JgA при селективной недостаточности.
Гипергаммаглобулинемия определяется при хронических инфекционных процессах, а также системных заболеваниях соединительной ткани. Гипергаммаглобулинемия не является специфическим симптомом и встречается при многих заболеваниях: миеломной болезни, макроглобулинемии, амилоидозе и других заболеваниях.
При миеломной болезни определяется подъем JgA или JgG.
Подъем JgM может появляться при макроглобулинемии.
Определение количества Т– и В-лимфоцитов в периферической кровиОсновные функции иммунной системы выполняют 2 класса лимфоидных клеток: Т– и В-лимфоциты. Т-лимфоциты и часть В-лимфоцитов находятся в периферической крови и тканевых жидкостях организма.
Т-лимфоциты делятся на 4 группы:
– киллеры, уничтожающие чужеродные и собственные клетки;
– хелперы, которые принимают участие в дифференцировке клеток;
– эффекторы, выделяющие лимфокины и гуморальные медиаторы, которые вовлекают клетки в реакцию активации макрофагов, и т. д.;
– супрессоры, которые тормозят иммунный ответ.
Среди Т-лимфоцитов обнаружены клетки памяти, которые при повторном контакте с антигеном выполняют свои функции активнее, чем при первичном контакте.
При первичной встрече с антигеном синтезируются антитела, относящиеся к JgM (с 4-го по 7-й день), затем класса JgG, а в конце – класса JgA. При первичном контакте образуется клон В-лимфоцитов, имеющих иммунологическую память.
При вторичной иммунной симуляции вырабатываются антитела класса G. В норме число Т-лимфоцитов составляет 70–80 % от общего числа лимфоцитов периферической крови. При первичном иммунодефиците число Т-лимфоцитов снижается. Это наблюдается и при красной волчанке, и хроническом активном гепатите. Методы выявления Т-лимфоцитов основаны на выявлении поверхностных маркеров различных типов Т-лимфоцитов. Маркерами служат специфические антигены лимфоцитов и их рецепторы.
Для выявления Т-лимфоцитов применяются специфические сыворотки. К таким методам относятся цитотоксическая реакция, реакция иммунофлюоресценции, непрямой метод выявления антигенов Т-лимфоцитов с использованием белка А стафилококка, определение Т-лимфоцитов в ходе проведения теста с эритроцитами барана.
Методы определения В-лимфоцитов основаны на определении специфических антигенов В-лимфоцитов и их рецепторов. Существуют следующие реакции выявления В-лимфоцитов: антитоксическая с антисывороткой против антигенов, с антиглобулиновой сывороткой, метод обнаружения иммуноглобулиновых рецепторов с использованием стафилококков, содержащих белок; метод иммунофлюоресценции с меченными антисыворотками.
Применение радиоизотопных методов позволило установить существование 2 популяций лимфоцитов: короткоживущих (продолжительность их жизни около 4 дней) и долгоживущих (до 170 дней).
В периферической крови Т– и В-лимфоциты распределяются следующим образом:
– В-лимфоциты – 25–30 %;
– Т-лимфоциты – 60 %;
– ни В-, ни Т-лимфоциты – до 10 %.
Лимфоциты обеспечивают специфическую основу иммунитета. При первичном иммунодефиците отмечается снижение В-лимфоцитов. Повышение числа В-лимфоцитов диагностического значения не имеет.
Основные методы определения специфической реактивностиСуществуют следующие методы.
1. Определение Т– и В-лимфоцитов и их популяций с эритроцитами барана или мыши.
2. Метод моноклональных антител, различающихся по СD-рецепторам, с использованием моноспецифичной сыворотки. Исследование проводится на люминесцентном микроскопе или проточном цитометре.
Определение количества иммуноглобулинаПроводится следующими методами:
1) радиальная иммунодиффузия в геле с моноспецифическими сыворотками по Манчини;
2) нефелометрический метод с моноспецифическими сыворотками по Чиркину;
3) иммуноферментные методы на ИФА.
Содержание иммуноглобулинов класса А, М, G изменяется при иммунодефицитных состояниях, определяется при вирусных гепатитах и миеломной болезни.
Особенно важно для дифференциальной диагностики и прогноза заболеваний.
Определение циркулирующих иммунных комплексовЦиркулирующие иммунные комплексы определяются при инфекционных и неинфекционных заболеваниях нефелометрическим методом.
Применение методов группы ЭЛИ-тест
Методы группы ЭЛИ-тест позволяют выявить специфические иммунные изменения, способы влияний на деятельность клеток различных типов.
Методы основаны на твердофазном иммуноферментном анализе, при котором выявляются аномалии в сывороточном содержании аутоантител класса JgG определенной антигенной специфичности.
Методы дают возможность анализировать характер изменений в сывороточном содержании аутоантител. Техника постановки методов указывается в инструкциях, прилагаемых к наборам иммунореагентов.
ЭЛИ-АИМ-тест определяет сывороточное содержание аутоантител к фрагментам ДНК, В2-гликопротеину-1, Fc-фрагментов иммуноглобулинов (ревматоидный фактор); выявляет содержание ряда естественных антител, который указывает на изменение общей активности иммунной системы.
ЭЛИ-Гамма-тест используется для мониторинга динамики подострых и хронических тканевых деструктивных процессов. При исследовании происходит оценка сывороточного содержания аутоантител, направленных к гамма-интерферону и его рецепторам.
ЭЛИ-ДИА-тест применяется для оценки содержания аутоантител, направленных к инсулину и инсулиновым рецепторам.
Повышение уровня антител к инсулину является признаком патологических изменений в бета-клетках островков Ларгенганса, типично для развития диабета I типа.
Повышение сывороточных аутоантител выявляется у больных, страдающих диабетической ангиопатией.
ЭЛИ-Тиро-тест определяет сывороточное содержание аутоантител к тиреоглобулину при тереоидитах аутоиммунного генеза.
Этот тест выявляет начинающиеся патологические изменения в щитовидной железе и дает возможность наблюдать за динамическими изменениями ее функции.
ЭЛИ-Кор-тест дает возможность оценить сывороточное содержание аутоантител, направленных к антигенам миокарда, а также установить имеющиеся или начинающиеся патологические изменения в миокарде.
ЭЛИ-Пульмо-тест выявляет имеющиеся или начинающиеся патологические изменения в легких и позволяет контролировать за их динамикой их при заболеваниях легких.
ЭЛИ-Гепато-тест выявляет имеющиеся или начинающиеся заболевания печени.
ЭЛИ-Нефро-тест позволяет оценить сывороточное содержание аутоантител, направленных к антигенам почек, и выявить почечные заболевания.
ЭЛИ-Гастро-Интестино-тест выявляет и оценивает сывороточное содержание аутоантител, направленных к ряду антигенов стенок желудка, кишечника, выделяемых в повышенных количествах.
ЭЛИ-Тромбо-тест выявляет аутоантитела к антигенам тромбоцитов, что позволяет диагностировать аутоиммунные тромбоцитопатии и васкулиты разной этиологии.
ЭЛИ-Н-тест определяет сывороточное содержание нейротропных аутоантител при раннем выявлении процессов, затрагивающих структуры центральной нервной системы.
ЭЛИ-ОБМ-тест выявляет демиелинизирующие заболевания.
ЭЛИ-П-комплекс рекомендуется проводить у женщин, готовящихся к беременности, или у женщин в I и II триместрах беременности.
С помощью теста определяются аутоантитела класса JgG к хорионическому гонадотропину, ДНК, гликопротеинам, коллагенам, ряду аутоантител к белкам.
Поступление к плоду избытка аутоантител может сопровождаться эмбриотоксическим и эмбриоцидным эффектами.
Ход развития эмбриона регулируют аутоантитела к белкам S-100, MP-65.
Аутоантитела к белку S-100 участвуют в регуляции гибели клеток развивающегося плода, а также в регуляции созревания нейробластов.
Антитела к белку МР-65 принимают участие в регуляции процессов морфогенеза и созревания различных органов. Недостаток продукции и поступления аутоантител к белкам S-100 и МР-65 может привести к возникновению пороков развития и даже гибели плода.
Подъем продукции аутоантител к белкам S-100 увеличивает риск остановки беременности и десятикратно повышает риск развития патологии нервной системы плода.
Часто длительное нарушение продукции аутоантител приводит к невынашиванию беременности, нарушению в закладке органов плода, бесплодию.
ЭЛИ-СПР-тест проводится у женщин, которым долгое время не удается забеременеть.
Он выявляет и оценивает содержание антиспермальных аутоантител, направленных к мембранным белкам сперматозоидов человека. При избытке последних происходит снижение фертильности.
Преимущества метода иммуноферментного анализа
Иммуноферментный анализ является иммунохимическим методом и применяется с диагностической целью. Использование этого метода включает в себя проведение следующих этапов:
1. Производится сорбция на твердую основу антигена для выявления антител к нему (в лунки полистеронового ИФА планиата).
2. Вносится антиген в лунки биопроб, в которых выявляются специфические антитела.
3. Производится инкубация системы, во время которой происходят специфические взаимодействия антител и антигена на твердой основе.
4. Производится инкубация системы в течение определенного времени после внесения в систему раствора фермента, молекулы которого конъюгированы с антивидовыми антииммуноглобулинами;
5. В систему вносится хромогенный субстрат, разлагающийся под действием фермента с антивидовыми антителами;
6. Происходит образование окрашенного продукта, этот процесс выявляется фотометрически или визуально. Метод твердофазового неконкурентно-иммуноферментного анализа, лежащего в основе методов группы ЭЛИ-тест, обладает следующими преимуществами:
1) возможностью использовать минимум исследуемого материала;
2) высокой чувствительностью;
3) стабильностью реагентов;
4) возможностью автоматизации.
Применяются и другие иммунологические методы диагностики: встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ), радиоиммунный анализ (РИА) и др.
Определение антител к определенным классам иммуноглобулинов (JgM, JgG, JgA и др.) дает возможность дифференцировать заболевание с другими иммунными заболеваниями.Данный текст является ознакомительным фрагментом.