Глава 5 Биохимические методы исследования

Глава 5 Биохимические методы исследования

Биохимические методы исследования биологических жидкостей в клинической лабораторной диагностике

Исследование белков плазмы крови

Плазма крови здорового человека содержит более 200 различных белковых компонентов.

Большая часть выполняемых кровью функций так или иначе связана с белками плазмы:

1) поддержание коллоидно-осмотического давления;

2) участие в процессах свертывания крови;

3) регуляция рН крови;

4) транспортная функция;

5) защитная функция;

6) функция «белкового резерва» и др.

К белкам плазмы крови относится группа белков, удовлетворяющих следующим требованиям:

1) содержатся в плазме крови;

2) синтезируются в печени или ретикулоэндотелиальной системе;

3) проявляют основную функцию в пределах сосудистой системы;

4) в кровь секретируются, а не попадают в результате повреждения тканей;

5) находятся в плазме в большей концентрации, чем в других биологических жидкостях;

6) могут проявлять генетически обусловленный полиморфизм или иметь вариантные формы, но это не связано с их тканевым происхождением;

7) не являются продуктами катаболического протеолиза в плазме, но могут быть продуктами ограниченного протеолиза;

8) имеют большее время биологического полураспада в плазме, чем время транспорта по крови.

Основными представителями белков плазмы крови являют ся альбумины, глобулины и фибриноген.

В клинической практике большее развитие получили исследования не плазмы, а сыворотки крови, т. е. крови, лишенной форменных элементов, фибриногена и части белков свертывающей системы.

Общее содержание белка в сыворотке крови определяется различными способами: рефрато-, осмо-, вискозиметрически, спектрофотометрически, биуретовым методом и т. д. Наибольшее распространение в практике КДЛ получил фотометрический биуретовый метод определения общего содержания белка (унифицированный метод).

Унифицированные методы исследования в биохимической лаборатории

Фотометрические методы исследования

В клинико-диагностических лабораториях для исследования состава и свойств биологических жидкостей широко используются фотоэлектроколориметры, фотометры, спектрофотометры, нефелометры, флуориметры, рефрактометры, хемилюминометры. Эти приборы и построенные на их основе анализаторы образуют класс фотометрических приборов. Своим названием этот класс приборов обязан фотометрическому принципу детектирования результата: измерение энергии светового потока с помощью фотодетекторов, преобразующих световую энергию в электрический сигнал.

Фотометрические методы исследования базируются на способности растворов поглощать, отражать или рассеивать электромагнитное излучение. Жидкие среды могут даже излучать электромагнитную энергию под воздействием световой энергии возбуждения или в результате химической реакции.

Абсорбционный метод анализа

На абсорбционном методе анализа основан принцип действия самых распространенных фотометрических приборов для лабораторных исследований – спектрофотометров и фотоколориметров.

Фотоколориметры предназначены для определения количества окрашенного вещества путем измерения величины поглощения и пропускания в видимой части электромагнитного спектра.

Принцип работы колориметра

Источником света для видимого участка спектра служит вольфрамовая лампа накаливания, которая формирует световой поток.

Диафрагма из светового потока вырезает узкий луч, создавая как бы «точечный» источник света. Оптическая система формирует параллельный поток световой энергии, который проходит через полосовой фильтр. Фильтр пропускает световой поток с максимальной длиной волны в диапазоне длин волн. Площадь и форма пятна, образуемого световым потоком на чувствительной площадке детектора-фотоприемника, остается постоянной. Она не зависит в заданных пределах от объема раствора в кювете и смены кюветы в кюветном отделении.

Фотоприемник трансформирует световую энергию в электрическую. Аналоговый сигнал в виде тока преобразуется аналого-цифровым преобразователем в цифровую форму. Микро-ЭВМ пересчитывает цифровой сигнал, принятый с преобразователя, в единицы измеряемых параметров.

Основное назначение абсорбциометрических приборов – определение концентрации растворов с исследуемым веществом посредством сравнения величин поглощения или пропускания световой энергии исследуемого раствора и раствора известной концентрации. В настоящее время в КДЛ можно встретить большое разнообразие по конструкции и характеристикам колориметров, фотометров, спектрофотометров.

Приборы могут отличаться:

1) по форме представления информации (в единицах оптической плотности, в единицах концентрации, в единицах светопропускания или в любых других значениях, по которым была произведена калибровка;

2) по способу подачи в прибор исследуемого раствора (проточная кювета, коммутируемая кювета, 96-луночный планшет и т. д.;

3) по способу построения и хранения калибровочных значений (ручное, автоматическое, длительное или краткосрочное);

4) по виду источника излучения световой энергии (разнообразные лампы накаливания: вольфрамовые, импульсные, газоразрядные, светодиоды, лазеры);

5) по конструкции оптической системы (одноканальные и многоканальные).

Нефелометрический метод анализа

Этот вид исследования проводится в дисперсных средах с целью определения концентрации, размера и формы диспергированных частиц.

Турбидиметрический метод анализа Данный вид исследования мутных сред основан на измерении изменения интенсивности потока световой энергии, прошедшего через дисперсную систему. Изменение потока световой энергии вызвано как поглощением, так и его рассеянием дисперсной системой. Преимущество турбидиметрического анализа заключается в том, что измерения могут быть выполнены практически на любом колориметре или фотометре. Повышение чувствительности турбидиметрических исследований может быть достигнуто за счет использования спектрофотометров с высококачественными детекторами.

Флуориметрический метод анализа

Этот метод основан на явлении, которое называется флуоресценцией. Световая энергия, поглощенная атомами или молекулами, отдается ими в виде светового же излучения.

Спектр излучения флуоресценции многих веществ носит избирательный характер. Он не зависит от длины волны возбуждающего света. Это показывает, что спектр флуоресценции характеризует исследуемое вещество и является основой для обнаружения и идентификации этих веществ. Существуют многочисленные физико-химические факторы отклонения от пропорциональности энергии поглощения и энергии флуоресценции от концентрации исследуемого раствора. При практических определениях концентрации раствора по световой энергии требуется предварительное построение градуировочных кривых. Градуировочная кривая строится по результатам измерений флуоресценции растворов с известной концентрацией.

Рефлектометрический метод анализа

Количественное определение содержания веществ на твердофазных носителях реактивов условно называется системами сухой химии. Измеряется интенсивность светового потока, отраженного от окрашенной поверхности носителя, которая зависит от концентрации исследуемой жидкой пробы. Определение изменения цвета окрашенной поверхности производится методом рефлектометрии. В качестве носителя сухих реагентов выступают реагентные полоски. Они наиболее широко используются для экспресс-анализа мочи и крови.

Хемилюминесцентный анализ

Это один из люминесцентных методов анализа. Принцип метода состоит в том, что при реакции окисления происходит возбуждение молекул продуктов реакции и выделение световой энергии при возвращении их в основное состояние.

Частный случай хемилюминесценции – биолюминесценция. При биолюминесценции выделение световой энергии излучения происходит в результате окислительного процесса, который катализируется ферментами-люциферазами. Поскольку ферменты чрезвычайно избирательны, то биолюминесцентные методы очень специфичны.

Приборы, на которых производят хемилюминесцентный анализ, называются люминометрами.

Наиболее трудоемкой в лабораторных исследованиях является подготовка пробы к проведению анализа. Для сокращения трудозатрат, времени, повышения качества исследований и достоверности результатов в лабораторную практику внедряется широкий арсенал приспособлений, специализированных устройств и приборов пробоподготовки.

На качество и точность результатов лабораторных исследований существенное влияние оказывает аккуратное и точное выполнение операций дозирования.

Основные режимы дозирования:

1) прямое;

2) обратное;

3) многократное и режим разведения.

Прямое дозирование – весь забранный объем жидкости сбрасывается за один полный ход поршня. Этот режим подходит для дозирования водных растворов.

Обратное дозирование – в наконечник набирается несколько больший, по сравнению с дозируемым, объем жидкости.

Остающийся в наконечнике некоторый объем жидкости нивелирует погрешность, связанную с образованием пены или мениска. Этот режим подходит для очень малых объемов, а также для вязких и пенящихся жидкостей.

Многократное дозирование – повторяющиеся операции дозирования идентичных или различных объемов жидкости.

Режим разведения жидкости – в наконечник дозатора забирается первый объем, а затем перед забором второго создается воздушная подушка, и обе жидкости выливаются вместе.

Пипеточные дозаторы

Это бесклапанные дозаторы. Забор и выдача пробы осуществляются через один и тот же наконечник дозатора. Забор дозирующей жидкости осуществляется в съемную насадку (наконечник). Пипеточные дозаторы нашли самое массовое применение в лабораторной практике.

Пипеточный диспенсер (степпер) осуществляет разовый забор дозируемого раствора в наконечник пипеточного дозатора. Затем через этот же наконечник осуществляется многократное пошаговое дозирование.

Пипеточный дилютер – через наконечник осуществляется последовательно забор различных жидкостей разных объемов. Через этот же наконечник выдается весь суммарный объем жидкости, находящейся в нем.

Дозаторы подразделяются по способу установки дозы на дозаторы с фиксированным объемом дозы и дозаторы с регулируемыми переменными объемами дозы. Первыми в мире регулируемыми пипетками были пипетки фирмы Labsystems.

Дозаторы подразделяются по количеству каналов дозирования на дозаторы одноканальные и многоканальные. Многоканальные дозаторы наиболее удобны при работе с микропланшетами и стрипами.

По способу управления дозаторы делятся на дозаторы с ручным приводом, автоматическим приводом и автоматическим приводом и автоматическим управлением – электронные дозаторы.

Новым этапом в развитии технологии дозирования явились электронные пипетки. Финская компания BIOHIT предлагает широкую гамму однои многоканальных дозаторов.

Электронные микродозаторы имеют преимущества в сравнении с механическими:

1) возможность замены нескольких обычных и специальных пипеток одной электронной, в том числе таких, как диспенсер, дилютер и миксер;

2) возможность дозирования в диапазоне от 0,2 до 25 000 мкл;

3) более высокая точность дозирования и воспроизводимость по сравнению с механическими пипетками;

4) легкость управления и небольшой вес позволяют в течение рабочего дня выполнять более 1000 манипуляций;

5) автоматическая калибровка;

6) возможность подзарядки от сети.

Для разделения неоднородных жидких сред применяется центрифугирование. Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле.

В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью.

Препаративное центрифугирование заключается в выделении биологического материала для последующих биохимических исследований. С помощью препаративного центрифугирования выделяют большое количество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности.

Препаративные центрифуги можно подразделить на 3 основные группы: центрифуги общего назначения, скоростные центрифуги и препаративные ультрацентрифуги.

Центрифуги общего назначения обеспечивают центрифугирование с максимальной скоростью 8 тыс. оборотов в минуту. Они отличаются друг от друга емкостью и имеют ряд сменных роторов: угловых и с подвесными стаканами или другими контейнерами.

Центрифужные пробирки вместе с их содержимым должны быть тщательно уравновешены. Необходимо загружать четное число пробирок в ротор, размещая их симметрично.

Скоростные центрифуги развивают скорость 25 тыс. оборотов в минуту. Камера ротора снабжена системой охлаждения для предотвращения нагревания, возникающего при вращении ротора.

Препаративные ультрацентрифуги обеспечивают центрифугирование со скоростью до 75 тыс. оборотов в минуту.

К центрифугам специального использования относятся рефрижераторные центрифуги, центрифуги с нагревательной рубашкой и др.

Аналитическое центрифугирование применяется для изучения чистых препаратов макромолекул или частиц, например рибосом.

В данном случае используется небольшое количество материала. Седиментация исследуемых частиц непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярной массе и структуре материала.

Аналитические центрифуги развивают скорость до 100 тыс. оборотов в минуту. Через заданные промежутки времени седиментирующий материал можно фотографировать.

Для проведения лабораторных анализов необходимы термостатирующие устройства, которые могут быть в виде самостоятельных приборов или могут входить в качестве блоков в общую структура автоматических анализаторов.

Термостаты по принципу передачи тепловой энергии подразделяются на жидкостные, суховоздушные, сухие.

В жидкостных термостатах передача тепловой энергии от источника тепла к объекту термостатирования происходит через жидкую среду. Такие термостаты обладают высокими метрологическими характеристиками.

В лабораторной практике широкое распространение получили суховоздушные и сухие термостаты. В суховоздушных термостатах тепловая энергия передается за счет циркулирующего потока воздуха. В сухих термостатах передача тепловой энергии идет через массивный металлический блок к объекту: пробирке, колбе.

Выбор способа термостатирования определяется назначением, емкостью и формой термостатируемого объекта.

С целью ускорения проведения реакции и улучшения воспроизводимости результатов исследования применяются перемешивающие устройства. Выбор типа движения и его характеристик от простейшего качающего и вращательного движения до сложного знакопеременного ротационного движения зависит от конкретного назначения устройства. Перемешивание не должно вызывать появления пены и пузырей, которые могут повлиять на результаты измерений.

В автоматических анализаторах перемешивание может осуществляться непосредственно струей впрыскиваемого в кювету автоматическим дозатором реагента.

Гемолиз

Гемолизированная сыворотка и плазма непригодны для анализа многих компонентов (железа, ЛДГ, кислой фосфатазы, АсАТ, АлАТ, калия, магния, креатинина, билирубина, белковых фракций, осадочных проб и т. д.) в силу различных причин (более высокого содержания компонентов в эритроцитах и перехода веществ из них в сыворотку (плазму при гемолизе); химической или оптической интерференции гемоглобина в методах.

Видимый гемолиз распознается при пограничной концентрации гемоглобина 0,2 г/л. Уже при концентрации 1,0 г/л сыворотка плазма окрашивается в отчетливо красный цвет.

Билирубинемия Интерферирует в методах, основанных на фотометрических измерениях в коротковолновой области спектра видимого света (300–500 нм). Однако путем постановки холостых проб на сыворотку или разведения пробы (креатинин, изменения порядка добавления реактивов, экстракции, снижающих влияние билирубина) удается получить приемлемые результаты.

Липемия При липемии происходит помутнение сыворотки или плазмы вследствие высокого содержания хиломикронов после приема пищи, богатой жирами. Отчетливая мутность возникает при концентрации триглицеридов более 4,5 ммоль/л. Степень и характер мутности, вплоть до сливкообразного характера сыворотки, зависят от состава и концентрации протеинов в ней. В некоторых случаях липемия может быть скорригирована постановкой специальных холостых проб. Следует запрашивать свежую биожидкость для исследования, взятую натощак.

Мутность материала

Мутность материала для исследования может быть обусловлена ростом бактерий, попавших в пробу, особенно при длительном транспорте и неправильном хранении. В этих случаях материал непригоден для анализа.

Помимо указанных, критериями неприемлемости биоматериала для анализа в лаборатории являются:

1) отсутствие номера на пробирках, перепутывание направлений на анализ;

2) несоответствие объема собранной крови количеству добавляемого антикоагулянта;

3) использование неправильных, интерферирующих в определении данного компонента антикоагулянтов, например использование фторида натрия при взятии крови, предназначенной для определения мочевины уреазным методом;

Данный текст является ознакомительным фрагментом.